原文出处

DammeijerF,vanGulijkM,MulderEE,LukkesM,KlaaseL,vandenBoschT,vanNimwegenM,LauSP,LatupeirissaK,SchettersS,vanKooykY,BoonL,MoyaartA,MuellerYM,KatsikisPD,EggermontAM,VromanH,StadhoudersR,HendriksR,ThüsenJV,GrünhagenDJ,VerhoefC,vanHallT,AertsJG.ThePD-1/PD-L1-CheckpointRestrainsTcellImmunityinTumor-DrainingLymphNodes.CancerCell.;S-(20)-3.

研究背景

PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗为肿瘤的治疗带来了突破性的进展，通常认为PD-1/PD-L1阻断治疗通过削弱肿瘤微环境中肿瘤细胞介导的T细胞抑制而发挥作用。然而，已有研究显示PD-L1亦可在巨噬细胞和树突状细胞等非肿瘤细胞中表达。然而，PD-L1在这些细胞中的发挥的作用仍有待进一步的研究。在本研究中，作者的研究显示，小鼠肿瘤模型的肿瘤引流淋巴结（Tumor-draininglymphnodes,TDLNs）中富含肿瘤特异性PD-1+T细胞，这些T细胞与PD-L1+常规树突状细胞（conventionaldendriticcells,cDCs）密切相关。胸膜内低剂量注射PD-L1抗体可成功靶向TDLNs，且TDLNs靶向的PD-L1阻断可通过增加TDLNs中具有干性表型的SLAMF6+肿瘤浸润T细胞（称为TEXprog细胞）在多种小鼠肿瘤模型中增强抗肿瘤T细胞免疫，抑制肿瘤生长。TDLNs靶向的PD-L1阻断的这种作用主要是依赖于TDLN中PD-L1表达的cDCs，而非巨噬细胞。此外，在非转移性黑色素瘤患者中，TDLNs中存在大量的PD-1/PD-L1相互作用，且这一作用与患者早期的疾病复发相关，

研究结果

1.肿瘤引流淋巴结中富含PD-1+肿瘤特异性T细胞

为探究淋巴结中PD-1/PD-L1轴的活性，作者将表达卵清蛋白（ovalbumin,OVA）的间皮细胞瘤AE17肿瘤细胞（AE17-OVA）腹腔注射至小鼠体内，在疾病晚期，取纵膈淋巴结（腹膜腔的肿瘤引流淋巴结，即TDLN）和腹股沟淋巴结（非肿瘤引流淋巴结，即non-TDLN，用作实验对照），并对分析了淋巴结中肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的数量和表型进行分析。结果显示，腹股沟淋巴结中几乎不含OVA-特异性CD8+T细胞，而在纵膈淋巴结中则含有较高水平的OVA-特异性CD8+T细胞（Fig.1A），与non-TDLN中肿瘤抗原特异性CD8+T细胞相比，TDLN中肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的增殖能力更强，并有更多的CD8+T细胞表达PD-1（Fig.1B）。此外，TDLN中PD-1+CD8+T细胞的比例与肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的频率显著相关（Fig.1C），表明PD-1+CD8+T细胞比例可作为肿瘤特异性的标志。同样地，在KPC3-OVA荷瘤小鼠淋巴结中，也获得了相似的结果（Fig.1D）。对某些实体瘤模型中PD-1+CD4+T细胞和PD-1+CD8+T细胞的检测结果显示，除KPC3胰腺癌肿瘤模型外，TDLNs中PD-1+T细胞的比率均明显高于non-TDLNs，表明这一差异与肿瘤类型、小鼠的遗传背景、肿瘤所处位置及T细胞亚群无关（Fig.1E）。鉴于TDLNs和non-TDLNs中CD45—细胞的含量均较低（Fig.1F），TDLNs和non-TDLNs中PD-1表达的差异可能不是由肿瘤转移引起的。如前所述，低免疫原性的KPC3胰腺癌细胞未引起TDLN中PD-1+T细胞的增加（Fig.1E），表明TDLN中PD-1的表达可能与肿瘤细胞的免疫原性相关。与这一假设相符的是，与其它肿瘤中获得的结果相似，表达OVA抗原的KPC3荷瘤小鼠模型中，TDLNs中PD-1+T细胞的比率明显高于non-TDLN（Fig.1E）。此外，与肿瘤内的T细胞类似，TDLNs中的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞除了高表达PD-1外，同时也表达其它的一些共抑制受体（如TIM-3和TIGIT）（Fig.1G）。与PD-1表达相比，其它一些与T细胞激活相关的指标（如增殖）在各种不同的肿瘤模型中并未出现一致的增加，尽管T细胞的绝对数量是增加的（Fig.1H,I）。

为进一步了解TDLNs中CD4+和CD8+PD-1+肿瘤特异性T细胞的特征及其动态改变，作者将CD45.1+OT-I和OT-II细胞注射至接种AE17-OVA肿瘤细胞的CD45.2+荷瘤小鼠中，并在不同的时间分析其频率和表型的改变（Fig.2A）。结果显示，CD45.1+细胞最初在二级淋巴器官中聚集，包括TDLN，随后迁移至血液中，并在注射后6天浸润至肿瘤组织（Fig.2B）。在归巢至TDLNs时，CD45.1+T细胞PD-1表达上调，增殖能力增加（Fig.2C），表明PD-1的表达与T细胞激活，而非T细胞衰竭相关。总体上，随着时间的推进，PD-1+T细胞更容易在TDLNs中聚集，且有一部分的细胞表达某些效应分子（包括IL-2、IFN-γ和颗粒酶B）（Fig.2D）。此外，与PD-1—CD4+T细胞和CD8+T细胞相比，PD-1+CD4+T细胞和CD8+T细胞表达更高水平的CD28、CD44、CD69和SLAMF6（Fig.2E）。以上结果表明，在PD-1表达及迁移至肿瘤之前，TDLNs中，而不是non-TDLNs中，早期效应T细胞（early-effectorTcells）已经启动了初步的激活。

2.肿瘤引流淋巴结中富含PD-L1高表达的包括迁移的常规树突状细胞在内的髓细胞

以往的研究显示，淋巴结的副皮质区中包含着复杂的髓细胞，包括CD11b+树突状细胞（dendriticcells,DCs）、CD+被膜下淋巴窦巨噬细胞（subcapsularsinusmacrophages,SSMs）、F4/80+髓窦巨噬细胞（medullarysinusmacrophages,MSMs）、1型和2型常规DCs（type1和type2conventionalDCs,cDC1和cDC2）及粒细胞。TDLN中驻留的髓细胞，包括SSMs和cDCs均高表达PD-L1，但粒细胞并未表达高水平的PD-L1。此外，在肿瘤内相应类型的髓细胞中也发现了与TDLN中相对应的髓细胞相当的PD-L1表达（Fig.3A）。有趣的是，尽管肿瘤微环境中的髓细胞高表达PD-L2，但TDLN中的髓细胞却低表达或不表达PD-L2（Fig.3A）。且与non-TDLNs相比，TDLNs中PD-L1的表达和髓细胞数量均较高（Fig.3B,C）。为明确是哪一种髓细胞表达PD-L1，进而抑制PD-1+T细胞，研究者对前述提及的髓细胞类型PD-L1表达进行了定量分析，结果显示，在所有的肿瘤模型中，cDC2s和SSM及MSM巨噬细胞PD-L1的表达尤其高（Fig.3D）。TDLN组织的多色共聚焦分析结果也显示，髓质中的F4/80+MSMs和淋巴结皮质中的CD11c+DCsPD-L1的表达最高，而粒细胞中PD-L1的表达极低（Fig.3E）。

有研究显示，依据CD11c和MHC-Ⅱ表达的不同，DCs可分为迁移DCs和驻留DCs（migratoryandresidentsubsets）（Fig.4A）。作者的研究发现，TDLNs中迁移的cDC2s的数量明显增加，且与cDC1s相比，cDC2s表达更高水平的PD-L1和CD80（Fig.4B-D）。以上结果表明，TDLNs中PD-L1+细胞的比例较non-TDLNs增加，尤其是巨噬细胞和cDC2s细胞。

3.胸膜内低剂量注射PD-L1抗体选择性靶向TDLNs

为探究选择性靶向TDLN中PD-1/PD-L1轴对肿瘤进展的影响，研究者建立了一个可使得治疗性PD-L1抗体选择性靶向TDLNs而抑制PD-L1抗体在肿瘤中的可使用性的系统。研究者将免疫检查点阻断抗体经胸膜内注射，使得其可直接引流至纵膈淋巴结，纵膈淋巴结是腹腔肿瘤的TDLNs，在这里，过剩的抗体可经由胸导管入血。治疗性抗体通过静脉注射或胸膜内注射，抗体分布通过一个荧光标记的抗大鼠IgG2a抗体进行检测，从而消除需要改变治疗性抗体本身对药物代谢动力学的潜在影响（Fig.5A）。抗体注射24h后，不论是经由静脉注射还是胸膜内注射，均可在体内检测到治疗性抗体与肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞的结合（Fig.5B）。静脉注射和胸膜内注射小鼠纵膈TDLNsSMMs、MSMs和cDC2s中PD-L1抗体的结合相当，且与体外直接对PD-L1抗体进行染色的结果一致（Fig.5C）。与以往non-TDLNs中PD-L1表达减少的报道相符，在非荷瘤小鼠中，PD-L1抗体与髓细胞的结合减少（Fig.5D）。此外，与荷瘤小鼠相比，非荷瘤小鼠中，胸膜内注射的抗体较静脉注射的抗体可更有效地到达TDLN中的被膜下细胞（SSMsCD11b+cDC2s）（Fig.5D），这并不是由于不同处理组间（胸膜内注射或静脉注射）PD-L1表达差异所致，因为在同型对照处理的小鼠中，不论是胸膜内注射，还是静脉注射，PD-L1表达均可有效反应PD-L1抗体与所有白细胞亚群的结合（Fig.5E）。表明肿瘤可能促进抗体从肿瘤血管向淋巴管的二次引流作用和直接抗体对TDLN的直接靶向作用增强治疗性抗体在TDLNs的沉积（Fig.5F）。综上，胸膜内注射可使得抗体成功靶向TDLNs。随后，研究者进一步通过抗体滴定确定了一个使得anti-PD-L1抗体只可在纵膈TDLNs发挥阻断作用，而不能进入腹腔肿瘤和循环体系的抗体剂量。如Fig.5G和Fig.5H所示，在抗体剂量为2.5μg时，TDLN中的巨噬细胞和CDCs仍有anti-PD-L1抗体的结合，而在non-TDLN、肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞和循环单核细胞及循环DCs中均未检测到anti-PD-L1抗体的结合。

4.特异性靶向肿瘤引流淋巴结的PD-L1抗体发挥抗肿瘤T细胞免疫和肿瘤控制的效用

为明确靶向TDLN中PD-1/PD-L1轴对肿瘤进展的影响，研究者在AC29间皮细胞瘤和MC38结肠癌两种同基因型小鼠肿瘤模型中分别评估了低剂量TDLN靶向anti-PD-L1抗体（2.5μg,胸膜内注射）和高剂量系统性靶向anti-PD-L1抗体（μg,胸膜内注射）的作用,结果显示，二者均可抑制肿瘤生长，增加小鼠生存（Fig.6A,B）。系统性靶向的anti-PD-L1抗体增加血中T细胞的增殖，TDLN靶向的anti-PD-L1抗体和系统性靶向的anti-PD-L1抗体均可增加CD69+细胞的比率，然而，在AC29肿瘤模型中，系统性靶向的anti-PD-L1抗体增加肿瘤浸润T细胞，而TDLN靶向的anti-PD-L1抗体特异性诱导KLRG-1+效应T细胞的浸润（Fig.6C）。此外，尽管几乎全部的肿瘤浸润T细胞均为TOX阳性，但不论是系统性靶向anti-PD-L1抗体处理还是TDLN靶向anti-PD-L1抗体处理的小鼠肿瘤组织中T细胞的TOX表达均显著减少（Fig.6C）。最近的一项研究显示，肿瘤内可能存在具有干性表型的TCF1+CD8+T细胞，这些细胞可产生不同的T细胞亚群，包括终末分化的衰竭T细胞。在作者的研究中也发现了一类具有干性表型的SLAMF6+肿瘤浸润T细胞（称为TEXprog），这类细胞低表达Ki-67、TIM-3和CD39（Fig.6D,E）。SLAMF6作为TCF1表达的标志分子（Fig.6F）。此外，系统性PD-L1阻断和选择性TDLNPD-L1阻断均可增加肿瘤内CD8+和CD4+TEXprog细胞，且肿瘤内TEXprog细胞的增殖能力降低，表明在接受系统性靶向anti-PD-L1抗体处理和TDLN靶向anti-PD-L1抗体处理的小鼠肿瘤内的TEXprog细胞仍可保留其干性特征。

5.FTY废除系统性和TDLN特异性anti-PD-L1免疫治疗的作用

为明确anti-PD-L1处理所致TDLN中T细胞激活的作用，研究者在anti-PD-L1抗体治疗期间使用了可废除由淋巴器官输出的T细胞作用的S1P受体激动剂FTY。淋巴器官中T细胞的滞留通过外周血中T细胞比例的降低得到验证（Fig.7A）。FTY废除了anti-PD-L1处理对肿瘤生长的抑制作用，并抑制肿瘤内CD4+Th细胞和CD8+T细胞的浸润，但仍保留PD-1+CD8+T细胞的浸润（Fig.7B,C）。此外，FTY还可中和自发的及系统性和TDLN靶向的anti-PD-L1处理诱导的肿瘤内CD8+和CD4+TEXprog细胞（Fig.7D,E）。以上结果表明，PD-L1阻断发挥效用不仅依赖于重振肿瘤微环境内的T细胞，也与TDLN中包括TEXprog细胞在内的T细胞的起始和激活相关。

6.PD-L1抗体阻断增强TDLNs中TEXprog细胞的诱导

为进一步确定阻断TDLNs或肿瘤浸润T细胞中PD-1/PD-L1轴所发挥的功能作用，作者将CD45.1+OT-I和OT-II细胞注射至接种AE17-OVA肿瘤细胞的CD45.2+荷瘤小鼠中，并检测了anti-PD-L1抗体处理对CD45.1+T细胞及肿瘤生长的影响（Fig.8A）。结果显示，与non-TDLN中CD45.1+T细胞相比，anti-PD-L1抗体处理后，TDLNs中CD45.1+T细胞的增殖明显增加（Fig.8B）。系统性靶向的anti-PD-L1抗体可逐步增强TDLNCD45.1+T细胞的增殖，且anti-PD-L1抗体处理的小鼠TDLN中CD45.1+T细胞的出现频率也明显增加，而接受同型对照处理的小鼠中则没有出现明显的变化（Fig.8C）。anti-PD-L1抗体处理在24h后可显著增加TDLN中内源性的CD45.1—TEXprog细胞，且在72h和h后可分别增加血中和肿瘤内的内源性CD45.1—TEXprog细胞（Fig.8D）。多次的系统性靶向anti-PD-L1抗体或TDLN靶向anti-PD-L1抗体处理均可减少小鼠的AE17-OVA肿瘤负荷（Fig.8E），但对肿瘤特异性T细胞的浸润无明显影响（Fig.8F）。

为评估anti-PD-L1抗体治疗对肿瘤浸润T细胞复制潜能和表型的影响，作者建立了一个体外的T细胞刺激分析方法，在有或无anti-PD-L1抗体处理的情况下，用在肿瘤微环境中出现的同种抗原刺激CD8+肿瘤浸润T细胞。在体外，anti-PD-L1抗体处理后，SIINFEKL肽（OVA-肽）刺激可明显上调CD8+T细胞中PD-1的表达及其激活（Fig.9A）。由于缺乏MHC-Ⅱ结合的OVA肽，这一诱导激活系统可选择性激活CD8+肿瘤浸润T细胞，而不能激活CD4+肿瘤浸润T细胞。与未接受淋巴结靶向anti-PD-L1抗体处理的小鼠相比，体外PD-L1阻断对接受淋巴结靶向anti-PD-L1抗体处理小鼠肿瘤浸润T细胞活性的诱导作用更强，表现为细胞频率增加、细胞增殖增强、PD-1的表达减少（Fig.9B）。以上结果表明，TDLN中的PD-L1阻断可其对结内肿瘤特异性T细胞的抑制作用，导致迁移至肿瘤部位的T细胞对OVA肿瘤抗原的响应增强。

7.对PD-L1阻断的响应不依赖于TDLN中的巨噬细胞

为探究TDLN中哪一类PD-L1表达的细胞与抑制T细胞反应相关，作者通过在胸膜内注射低剂量包裹磷酸二钠的脂质体的方法删除了淋巴结中的具有吞噬作用的巨噬细胞。如Fig.10A和Fig.10B所示，5%包裹磷酸二钠的脂质体在48h内即可有效删除TDLN中的SSMs和MSMs，而对cDC2细胞未产生明显影响。且non-TDLNs和腹腔肿瘤中的巨噬细胞也未受影响。更为重要的是，多次的TDLN靶向的包裹磷酸二钠的脂质体处理并未抑制anti-PD-L1抗体的治疗效果（Fig.10C,D），表明在该模型中巨噬细胞在anti-PD-L1抗体发挥治疗效用的过程中的作用基本可以忽略。作者进一步通过多色共聚焦显微镜对TDLNs中anti-PD-L1抗体结合的cDC2s和CD8+T细胞进行了可视化的共定位分析，结果显示，TDLNs中CD8+T细胞与SSMs及MSMs并不存在共定位，但可观察到较多的PD-L1+DCs和CD8+T细胞组成的细胞群（Fig.10E）。综上，免疫检查点阻断可在重振TDLN中肿瘤特异性T细胞中发挥了正向的作用，这可能主要是依赖于TDLN中PD-L1表达的cDC(2)s，而非巨噬细胞。

8.肿瘤引流淋巴结而非肿瘤内PD-1/PD-L1间的相互作用与黑色素瘤患者的预后相关

为明确肿瘤患者的TDLN中是否存在PD-1与PD-L1的相互作用，作者在选择了适合进行TDLN分析的黑色素瘤患者。为确定未发生淋巴结转移的黑色素瘤患者TDLN中PD-1/PD-L1轴的活性，作者通过邻位连接技术（proximityligationassay,PLA）对未经治疗的Ⅱ期黑色素瘤患者TDLNs中PD-1与PD-L1间的相互作用进行了检测（Fig.11A）。研究者进一步对TDLNs中存在PD-1与PD-L1相互作用的在手术后未出现疾病复发的Ⅱ期黑色素瘤患者及出现远端疾病复发的Ⅱ期黑色素瘤患者进行了分析，结果显示，与长期无疾病复发的患者相比，短期无复发生存患者的原发肿瘤中已知的某些预后因素，如肿瘤生长厚度Breslow’s-depth、溃疡和结节等更为明显。此外，在短期无复发的患者群体中也检测到了更多的PD-1/PD-L1相互作用（Fig.11B），表明短期无复发患者群体的抗肿瘤免疫监视可能未发挥效用。有趣的是，较短的短期无复发生存与PD-1/PD-L1间相互作用的强度相关，且这一相关关系与先前提及的各项预后因素无关（Fig.11C），表明PD-L1介导的这一免疫抑制过程与原发肿瘤的特征无关。为确定与PD-1/PD-L1相互作用相关的细胞类型，研究者结合PLA与多色免疫荧光染色，对CD8、CD11c和CD68进行了染色分析，结果显示，在缺乏CD8+T细胞的生发中心可观察到较强的PD-1/PD-L1相互作用，在淋巴结皮质亦可观察到大量的PD-1/PD-L1相互作用（Fig.11D）。与在小鼠实验中获得的结果相似，PD-1与PD-L1的相互作用主要来自CD8+T细胞与CD11c+DCs的相互作用，CD68+巨噬细胞与T细胞间基本无相互作用（Fig.11E）。为明确黑色素瘤患者肿瘤内的PD-1/PD-L1相互作用强度是否与TDLNs中PD-1/PD-L1相互作用强度相似，研究者采用PLA在相对应的原发肿瘤中检测了PD-1/PD-L1的相互作用。然而，与TDLN中PD-1/PD-L1相互作用相比，原发肿瘤中PD-1/PD-L1相互作用十分微弱（Fig.11F）。尽管原发肿瘤中PD-1/PD-L1的相互作用十分微弱，但肿瘤组织中并不缺乏PD-L1的表达（Fig.11G），表明PD-1/PD-L1相互作用微弱并不是由PD-L1表达缺乏所致。以上结果表明，TDLNs中PD-1/PD-L1相互作用或可用于高危患者群辅助免疫治疗的筛选。

研究结论

1.小鼠肿瘤模型中，肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中富含与PD-L1+常规树突状细胞（cDCs）密切相关的肿瘤特异性PD-1+T细胞；

2.TDLNs靶向的PD-L1阻断治疗可通过在肿瘤内播种衰竭的T淋巴祖细胞增强抗肿瘤T细胞免疫，从而控制肿瘤生长；

3.非转移性黑色素瘤患者TDLNs中存在大量的PD-1/PD-L1相互作用，且这一相互作用与早期的疾病复发相关，而原发肿瘤内PD-1/PD-L1相互作用却与早期疾病复发无明显相关关系。

校对：孟庆飞